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背景

煙草特有亞硝胺 (TSNAs) 是只存在于煙草、煙草制品和卷煙煙氣中的一類有害物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，煙草特有亞硝胺對人體危害性極大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國、西歐由煙草中亞硝胺導(dǎo)致的癌癥發(fā)病率超過 30%，由吸煙導(dǎo)致的肺癌發(fā)病率高達(dá) 80%。其準(zhǔn)確測定對正確評價(jià)吸煙對健康的危害以及推動低危害卷煙的研發(fā)具有重要意義。但是，TSNAs 在卷煙煙氣中的含量很低，卷煙煙氣背景復(fù)雜，含有數(shù)千種成分，所以卷煙煙氣中 TSNAs 的準(zhǔn)確定量難度很大。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜強(qiáng)大的分離功能和質(zhì)譜準(zhǔn)確的定性功能，能很好的分析痕量水平的 TSNAS，并且前處理方法簡單快速，與傳統(tǒng)的 GC-TEA 方法相比，靈敏度更高、選擇性更強(qiáng)。故本文參考中國煙草總公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn) YO/T 17-2012《卷煙主流煙氣總粒相物中煙草特有 N - 亞硝胺的測定 高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法》，采用 EClassical 3200L-MS2 Vertical 9100 液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對卷煙主流煙氣中的特有 N - 亞硝胺進(jìn)行測定，其四種物質(zhì)的定量限完全滿足并在靈敏度和檢測速度優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)的檢測需求。

實(shí)驗(yàn)方法

卷煙抽吸

按照 GB/T19609 抽吸卷煙，使用直線式吸煙機(jī)，采用 44mm 濾片收集 5 支卷煙的總粒相物。

樣品萃取

將濾片置于 50mL 錐形瓶中，準(zhǔn)確加入 15.0mL 含有 10.0ng/ml 混合內(nèi)標(biāo)的 0.1mol/L 乙酸銨萃取溶液；超聲萃取 30min 后，靜置 5min。取適量萃取液過 0.22um 水相濾膜，移至色譜分析瓶中進(jìn)行 HPLC-MS/MS 分析。

LC-MS/MS 儀器方法

依利特科技 EClassical 3200L 參數(shù):

• 色譜柱：SinoPak BEH T-C18 1.8μm 2.1×100mm
• 柱溫：45℃
• 流速：0.4mL/min
• 進(jìn)樣量：10μL

表 1 液相色譜梯度洗脫表

質(zhì)譜參數(shù)

以下參數(shù)以依利特科技 EClassical 3200L-MS2 Vertical 9100 三重四極桿質(zhì)譜儀為例，離子源參數(shù)及目標(biāo)化合物質(zhì)譜參數(shù)見表 2 和表 3。

表 2 質(zhì)譜離子源參數(shù)

表 3 化合物質(zhì)譜參數(shù)列表

結(jié)果與討論

本文方法優(yōu)化了色譜柱的選擇，由于該類化合物偏堿性，常規(guī)封端較弱的 C18 色譜柱會稍有拖尾現(xiàn)象，終選擇了采用 BEH 色譜柱，可以得到較好的峰形。另外，因?yàn)樵擃惢衔锖须娯?fù)性較強(qiáng)的氮原子，故采用 ESI + 模式進(jìn)行測定。流動相通過添加不同濃度的甲酸和緩沖鹽后的信號對比后，發(fā)現(xiàn)采用水和甲醇做為流動相可以得到較高的靈敏度和良好的色譜峰形，如下圖 1 顯示，各化合物的峰型對稱，每個(gè)色譜峰上都有足夠的采集點(diǎn)數(shù)，可以獲得準(zhǔn)確的結(jié)果及優(yōu)異的重復(fù)性，滿足現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求。經(jīng)過進(jìn)一步色譜條件優(yōu)化后其定量限可達(dá)到 0.01ng/ml，圖 2 中展示了 4 個(gè)化合物在 0.01ng/ml 濃度時(shí)的提取離子流色譜圖。

采用 0.1mol/L 乙酸銨溶液稀釋成 1ng/mL-20ng/mL 的系列校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。圖 3 為 4 個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線情況，各化合物線性關(guān)系均較好，R 均大于 0.998。

同時(shí)考察了 1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml 添加濃度下的加標(biāo)回收率和每個(gè)加標(biāo)濃度下 6 針的重現(xiàn)性測試 (見表 4)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有良好的回收率和重現(xiàn)性，完全滿足卷煙主流煙氣中特定 N - 亞硝胺含量的測定。

結(jié)論

本文采用 EClassical 3200L-MS2 Vertical 9100 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)建立了快速、高效可靠的 LC-MS/MS 實(shí)驗(yàn)方法測定卷煙主流煙氣中 4 種特定 N - 亞硝胺，為其測定提供了可靠的高通量檢測手段，同時(shí)數(shù)據(jù)顯示，其重復(fù)性和線性均較好，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足其標(biāo)準(zhǔn)需求，為用戶的高通量樣品的測定提供可靠的保障。

參考文獻(xiàn)

【1】金聞博，戴亞，恒田拓，金平正。煙草化學(xué)。北京：清華大學(xué)出版社，2000

依利特科技的 EClassical 3200L-MS2 Vertical 9100 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)具有其獨(dú)特專利的 HSID 自清潔技術(shù)，輕松應(yīng)對復(fù)雜煙草基質(zhì)的簡單萃取前處理過程，無需清洗維護(hù)，即可完成大量樣品分析，大大節(jié)省維護(hù)時(shí)間及成本。

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